انواع کروماتوگرافی و کاربرد هر کدام

کروماتوگرافی یک روش منحصر به فرد در جداسازی است که برای تفکیک اجزای تشکیل دهنده یک مخلوط شیمیایی بکار می‌رود. در نتیجه، با روش کروماتوگرافی (Chromatography)، به خوبی می‌توان اجزای تشکیل دهنده مخلوط‌ ها را با عبور دادن یک فاز متحرک از روی یک فاز ساکن از یکدیگر جدا و آنالیزهای لازم را بر روی اجزای تفکیک شده انجام داد. در ادامه این مطلب قصد داریم بررسی کنیم که کروماتوگرافی چیست و با انواع کروماتوگرافی بیشتر آشنا شویم.

تاریخچه کروماتوگرافی چیست؟

از متداول ترین و پرکاربردترین شیوه های جداسازی مواد تجزیه‌ای، انواع کروماتوگرافی است. این علم در تمام شاخه‌های علوم زیستی، پزشکی، شیمی و صنعتی کاربردهای فراوان دارد. انواع کروماتوگرافی دسته بندی های قابل توجهی از روش‌های جداسازی مواد را در برمی گیرند و این امکان را مهیا می کند تا اجزای سازنده نزدیک به هم مخلوط‌های پیچیده را جدا و شناسایی کند.

کروماتوگرافی در واقع لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری بوده و آمیخته ای  از دو واژه “کروما” به معنی رنگ و “گروفین” به معنی نوشتن می باشد. در سال ۱۹۰۳ برای اولین بار از این روش جداسازی مواد رنگی استفاده شد. این کار اولین بار توسط کشور روسیه و دانشمند ایتالیایی الاصلی به نام میخائیل‌ سوئت انجام گرفت. او از این روش برای جداسازی مواد رنگی استفاده کرد. مارتین و سینج به پاس زحماتی که در راستای انواع روش های کروماتوگرافی کشیدند، در سال ۱۹۵۲ در زمینه ی کروماتوگرافی جایزه نوبل دریافت کردند.

آشنایی با انواع کروماتوگرافی

در ادامه به شرح انواع کروماتوگرافی و روش هایی که برای آن وجود دارد می پردازیم.

روشهای کروماتوگرافی با توجه به نوع فاز متحرک و شکل فاز ساکن به دو گروه اصلی تقسیم میشوند:

 فاز متحرک: گاز یا مایع است، ولی جامد نیست.

فاز ساکن: مایع یا جامد است، ولی گاز نیست.

چنانچه فاز ساکن جامد باشد، کروماتوگرافی را کروماتوگرافی جذب سطحی و اگر فاز ساکن، مایع باشد کروماتوگرافی را تقسیمی می‌نامند. روش کروماتوگرافی کمک می کند تا ما بتوانیم اجزای یک مخلوط را در خاتمه واکنش اعم از واکنش دهنده های اضافی (باقی مانده) و فرآورده یا فرآورده های واکنش مورد نظر را از هم جدا کنیم.

انواع کروماتوگرافی براساس فاز متحرک و ساکن چهار نوع اصلی  دارد که عبارتند از:

1. کروماتوگرافی مایع – جامد

• کروماتوگرافی جذب سطحی
• کروماتوگرافی لایه نازک

2. کروماتوگرافی مایع – مایع (HPLC)

• کروماتوگرافی تقسیمی
• کروماتوگرافی کاغذی

3. کروماتوگرافی گاز – جامد و گاز- مایع (GC)

4. سایر روش های کروماتوگرافی

• کروماتوگرافی تبادل یونی

1. کروماتوگرافی مایع – جامد

روشی است که در آن فاز ثابت و نگه دارنده، یک فاز جامد است. در این روش متد اصلی برای جداسازی و نگه داشتن، از طریق فرآیند جذب است. در واقع برای جدا سازی مخلوط با این نوع کروماتوگرافی، ستون را با یک جسم جامد فعال مثل آلومینا یا سیلیکاژل پوشانده و مقداری از نمونه مایع را روی آن قرار می دهند. در ابتدا نمونه در بالای ستون کروماتوگرافی جذب می شود. سپس حلال استخراج کننده را در داخل ستون عبور می دهند. فاز متحرک، اجزای نمونه را با خود جابجا می کند، در نتیجه ذرات با تمایل جذب پایین تر، نسبت به ذرات با چسبندگی بیشتر، تند تر حرکت نموده و با سرعت بیشتری از ستون خارج می شود. با توجه به تفاوت سرعت حرکات ذرات، جداسازی صورت می گیرد.

کروماتوگرافی جذب سطحی (Absorption Chromatography)

نمونه‌ای از انواع دیگر کروماتوگرافی مایع – جامد است که در آن عمل جداسازی مواد به دلیل متفاوت بودن جذب سطحی اجزای مختلف مخلوط و فاز ساکن (جامد) انجام می‌گیرد.

کروماتوگرافی لایه نازک(TLC)

از انواع کروماتوگرافی جذب سطحی به حساب می آید، که در آن از صفحات با لایه نازک استفاده می شود و موقعیت اجزای جدا شده روی صفحه تعیین می گردد. در این روش جهت جدا کردن اجزای یک مخلوط، از یک فاز ثابت نازک که روی یک بستر بی اثر مانند صفحه شیشه ای یا ورق آلومینیومی قرار گرفته است، استفاده می گرد. ذرات روی لایه باید متراکم، همگن و کوچک باشند.

2. کروماتوگرافی مایع-مایع

در این روش، هردو فاز ثابت و متحرک، مایع هستند.

HPLC (کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا) به دلیل طیف گسترده ای از اصول جداسازی (کروماتوگرافی جذب، تقسیم، تبادل یون و حذف فضایی) برای همه آنالیزهای بیوشیمیایی قابل استفاده است. در این روش ستون ها که به ستون‌های HPLC معروف هستند، از یک فاز متحرک مایع استفاده می‌کنند. این نوع کروماتوگرافی، که به کروماتوگرافی مایع نیز معروف است، از ذرات بسیار کوچک و فشار نسبتا بالا در بکار گیری آن استفاده می شود. در HPLC، نمونه مورد نظر توسط یک مایع و با فشار بالا به داخل ستون کروماتوگرافی وارد می گردد.

کروماتوگرافی تقسیمی

کروماتوگرافی تقسیمی نمونه‌ای از انواع کروماتوگرافی مایع-مایع است که در آن فاز جامد (یک لایه از محلول است که روی سطح یک جامد ناصاف مثل سیلیکاژل و یا خاک سیلیسی قرار دارد) و فاز متحرک مایعی می باشد که غیر محلول در مایع اول است.

کروماتوگرافی کاغذی

کروماتوگرافی کاغذی مورد خاصی از انواع کروماتوگرافی تقسیمی به شمار می‌رود که در آن صفحات کاغذی جای ستون پر شده را می‌گیرند.

3. کروماتوگرافی گازی (GC)

چنانچه فاز متحرک یک گاز باشد، کروماتوگرافی گازی نامیده می شود. کروماتوگرافی گازی به طور گسترده ای برای جداسازی، شناسایی و تعیین کمیت اجزای نمونه ها به موقع استفاده می شود. در این روش معمولا از گازهای  بی اثر مانند نیتروژن، هلیوم و آرگون استفاده می گردد.

 کروماتوگرافی گازی از نظر نوع فاز ساکن به دو گروه تقسیم میشود:

چنانچه که فاز ساکن یک مادە ی جامد باشد، کروماتوگرافی گاز – جامد نامیده میشود و در صورتیکه فاز ساکن یک مایع باشد، کروماتوگرافی گاز – مایع نامیده میشود. درمورد کروماتوگرافی گاز- مایع، فاز ساکن مایع بر روی یک تکیه گاه جامد پوشش داده شده و درون یک ستون قرار داده می شود.

به هر دو نوع روش، کروماتوگرافی گازی (GC) گویند. روش کروماتوگرافی گازی، که در بین سایر روشها جداسازی بیشترین توسعه را پیدا کرده است، امروزه از رایج ترین روش ها، به ویژه برای جداسازی مخلوط گازها و مایعات و جامدات فرار است. حتی برای مخلوط های بسیار پیچیده زمان جداسازی به وسیله GC در حدود چند دقیقه می باشد. مواردی مثل: قدرت تفکیک زیاد، سرعت عمل تجزیه و حساس بودن روش GC باعث شده است که این روش تقریباً در همه آزمایشگاهها متداول باشد.

4. سایر روش های کروماتوگرافی

کروماتوگرافی تبادل یونی

از این روش برای جدا کردن یون‌ها و مولکول‌هایی که به آسانی قابلیت یونیزه شدن دارند، استفاده می‌شود. جداسازی یون‌ها به تمایل آن‌ها به فاز ساکن بستگی دارد، که با استفاده از تبادل یونی که صورت می گیرد. مواد آنالیز شده را بر اساس بار نسبیشان تفکیک می کنند. برهم‌کنش الکترواستاتیک بین مواد و دو فاز ساکن و متحرک موجب جدا شدن یون ها در نمونه می‌گردد. این روش معمولا به صورت ستونی انجام می گیرد، ولی می تواند به صورت صفحه ای نیز انجام شود. کروماتوگرافی تبادل یونی از یک فاز ثابت باردار برای جدا کردن ترکیبات باردار مانند آنیون ها، کاتیون ها، آمینواسیدها، پپتیدها و پروتئین ها استفاده می کند.

از جمله موادی که به طور متداول در این ستون‌ها استفاده می شوند : آمین‌ها، سولفونیک اسید، خاک دیاتومه (Diatomaceous Earth)، رزین‌های کراس لینک و استایرین دی‌ وینیل بنزن (Styrene-Divinylbenzene) موسوم به DVB هستند.

دستگاه HPLC و اجزای آن

HPLC (کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا) به دلیل طیف گسترده ای از اصول جداسازی (کروماتوگرافی جذب، تقسیم، تبادل یونی) برای همه آنالیزهای بیوشیمیایی قابل استفاده است.

دستگاهی که برای جداسازی و سنجش میزان اجزای یک ترکیب می باشد و مخفف High-Performance Liquid Chromatography  است که بیانگر کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا می باشد.

بخش های مختلف دستگاه HPLC

• پمپ
• انژکتور
• ستون
• آشکار ساز
• کنترل کننده
• گازگیر

دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC)

در دستگاه کروماتوگرافی گازی ، برای فاز متحرک غالبا از یک گاز بی اثر مانند هلیوم یا یک گازمنفعل مثل نیتروژن استفاده می شود. هلیوم تقریباً در ۹۰٪ دستگاه ها متداول ترین گاز انتقال دهنده است؛ اگرچه گاز هیدروژن برای بهبود جداسازی ها ارجعیت دارد. فاز ثابت در کروماتوگرافی گازی یک لایه بسیار نازک از مایع یا پلیمری است که بر روی یک جسم جامد خنثی در حکم تکیه گاه در داخل یک قطعه ی شیشه ای یا لوله فلزی به نام یک ستون قرار گرفته است. ابزاری که برای انجام این کار استفاده می شود گاز کروماتوگرافر نام دارد.

بخش های مختلف دستگاه آنالیز کروماتوگرافی GC:

• گاز حامل (carrier gas)
• انژکتور (sample injector)
• ستون (column)
• بخش گرمایش و دمای ستون (column temperature)
• دتکتور یا آشکار ساز

 از جمله برندهای معروف دستگاه HPLC  و GC میتوان به موارد زیر اشاره کرد :

1. Agilent
2. Shimadzu
3. waters

تفاوت HPLC با GC در چیست ؟

• بهره وری ستونهاي HPLC در اثر استفاده ی زیاد افت قابل توجهي نمي کنند؛ در صورتی که افت چشم گير كارائي و بهره دهي ستون هاي GC در كاربردهاي زياد موردي متداول است.
• در تکنیک HPLC دو فاز ثابت و متحرك بطور رقابتي عمل مي كنند و جداسازي بوسيله دو فاز صورت می گیرد، در صورتي كه در GC يك فاز يعني فاز ثابت عمل جداسازي را به تنهایی انجام مي دهد.
• براي استفاده از روش GC بايد ترکیبات را به مشتقات فرار تبديل كرد كه معمولا ترکیباتی ناپایدارهستند. از طرفی ايجاد مشتقات فرار و باقی ماندن جزئي از آن ها ايجاد پيك هائي مي كند كه نتايج آزمايش را با اختلال رو برو می سازد؛ در صورتی که جداسازي اين گونه مواد باHPLC امكان پذير است.
• از جمله مزاياي HPLC وجود دتكتورهاي آن است كه براي هر دسته از تركيبات دتكتورهاي انتخابي ويژه وجود دارد، در صورتي كه در GC دتكتورها محدود تر هستند.
• مدت زمان تجزیه و آنالیز در HPLC فوق العاده کوتاه است. امکان آناليز تركيبات آلي ناپايدار و مواد خوراكي، شيميايي، داروئي توسط HPLC میسر است.
• ترکیبات بسيار قطبي را با GC نمي توان آناليز كرد، در صورتي كه با HPLC این امکان وجود دارد.
• در HPLC به دلیل وجود دو فاز رقابتي پيك ها معمولا بصورت متقارن هستند، در صورتي كه در GC اکثرا پيك ها بصورت نامتقارن هستند و محاسبه مساحت زير منحني يا AUC با اشكال و خطا مواجه می باشد، در صورتیکه در HPLC به دلیل وجود تقارن محاسبه AUC به صورت دقيق قابل انجام است.
• نکته دیگر اینکه، وجود آب در نمونه هاي آزمايش در HPLC اشكال ايجاد نمي كند، در صورتي كه در GC وجود میزان بسیار کمی از آب هم دردسر ساز است و باعث تخريب دتكتور مي شود.
• وجود آب در شبكه كريستالي، وجود مولكولهاي آب هيدروژن در HPLC قابل تشخيص و بررسی، ولي در GC قابل ارزيابي نيست.
• بودن ناخالصی ها بخصوص ناخالصي هاي بسيار قطبي و يا با وزن مولكولي بالا در HPLC قابل تشخيص است، ولي در GC این امکان وجود ندارد.

سخن پایانی

با شناخت انواع کروماتوگرافی در این مطلب متوجه شدیم که تکنیک کروماتوگرافی نقش مهمی را در حوزه ی آزمایشگاهی، داروسازی و صنعت و … ایفا میکند. از نظر کاربردی و تکنیکی روشی پیچیده و حساس است که به ما امکان تفکیک و آنالیز اجزای یک ترکیب ناهمگن را می دهد. از این نظر مورد توجه بسیاری از کاربران آن قرار گرفته است. شما میتوانید جهت خرید تجهیزات مربوط به این شاخه به فروشگاه شرکت لیان آزما مراجعه کنید.