آموزش کنترل کیفی و کالیبراسیون سمپلر

میکروپیپت ها یا پیپت های پیستونی برای اندازه گیری حجم در زمینه هایی مانند بهداشت، شیمی، زیست شناسی، داروسازی و ژنتیک استفاده می شود. آزمایشگاه‌ها باید اطمینان حاصل کنند که نتایج به ‌دست‌آمده از این ابزار قابل اعتماد هستند. بنابراین کالیبراسیون سمپلر ها با استفاده از روش صحیح و برآورد کنترل صحت ضروری است. هدف از این کار ارائه بهترین روش برای کالیبراسیون میکروپیپت ها با توجه به شرایط اندازه گیری توصیف شده است.

چرا کنترل کیفی یا کالیبراسیون سمپلرها اهمیت دارد؟

پیپت کردن در محدوده میکرولیتر در حال حاضر کاری است که هر کاربری که از این دستگاه استفاده می کند، به عنوان یکی از مراحل کار با سمپلر انجام می دهد. (اگر علاقمندید تا در این خصوص اطلاعات بییشتری کسب کنید، میتوانید به مطلب دیگر ما با عنوان نحوه کار با سمپلر مراجعه کنید.)

سیستم‌های توزیع جدید اجازه می‌دهند آزمایش‌ها ساده ‌تر و بیشتر اتوماتیک شوند. اما در عین حال زمینه های جدیدی مانند ژنتیک، تقاضای سنگین تری را در مورد قابلیت اطمینان بودن نتایج دارند.

بنابراین مهم است که بر کالیبراسیون سمپلر و دیگر ابزار آزمایشگاهی و موضوع قابل اطمینان بودن یا نبودن در این حوزه تمرکز کنیم.

اندازه گیری حجم در هر آزمایشگاه آنالیز بسیار مهم است، به ویژه در تست های بسیار حساس، که از مقدار بسیار کمی مایع استفاده می کنند. اگر در این آزمایش ها یک اشتباه کوچک در پیپت کردن رخ دهد، ممکن است باعث خطای بزرگی در نتیجه نهایی شود. به منظور کاهش و شناسایی خطاهای احتمالی در جابجایی مایعات، کالیبراسیون سمپلرها در شرایطی مانند شرایط فوق در آزمایشگاه ضروری است.

هدف اصلی این مقاله بررسی و یافتن بهترین روش برای کالیبراسیون میکروپیپت ها بر اساس شرایط و موقعیت های اندازه گیری است.

روش های کنترل کیفی سمپلر

 دقت و صحت سمپلرها در سال، هر 3 ماه یک بار انجام می شود. کالیبراسیون سمپلرها با دو روش متداول صورت می گیرد؛

• روش رنگ سنجي
• روش حجم سنجي

روش اول : رنگ سنجی

1. کالیبراسیون سمپلر با رنگ سنجی ( رنگ سبز خوراكي )

به منظور انجام کالیبراسیون برای سمپلر های 100-10 میکرولیتر و همچنین سمپلرهای 1000-100 میکرولیتر یک محلول از رنگ سبز خوراکی بایستی به صورت ذخیره تهیه شود. جهت بررسی سمپلرها رقت 1 به 101 از اين رنگ براي هر سمپلر تهيه می گردد.

برای مثال با سمپلر 10، يك ميلي ليتر آب مقطر به ده لوله اضافه مي گردد. بعد از آن از رنگ آماده شده 10 ميكروليتر توسط سمپلر به هر لوله اضافه می شود.

در این متد باید از محلولی رنگی استفاده شود که جذب پایدار در طول زمان داشته باشد. مثلا رنگ سبزخوراکی با طول موج 630- 620 nm و یا رنگ پارانیتروفنل با طول موج 405-401 nm برای کالیبراسیون سمپلر استفاده می شود.

برای انواع سمپلر ها میتوانید از طریق دستورالعمل زیر اقدام کنید؛

• برای سمپلرهای 1000-100 میکرولیتر: 15.5 میلی گرم از پودر رنگ سبز خوراکی تهیه شده را باید در 100 میلی لیتر آب مقطرحل کنید. (میزان غلظت رنگ سبز خوراکی ذخیره برای این حجم سمپلرها ، 15.5 میلی گرم درصد می باشد.)
• برای سمپلرهای 100-10 میکرولیتر: 155 میلی گرم از پودر رنگ سبز ذکر شده را در 100 میلی لیتر از آب مقطر کاملا حل کنید. (عدد غلظت تعیین شده برای رنگ سبز در محلول در این دسته 155 میلی گرم درصد تعیین می شود.)
• سمپلرهای با حجم کمتر از 10 میکرولیتر: برای این دست از سمپلرها 1.55 میلی گرم از پودر رنگ سبزخوراکی را در 100 میلی لیترآب مقطر حل کنید. (عدد غلظت برای رنگ در محلول ذخیره 1.55 میلی گرم درصد می باشد.)

میزان غلظت محلول های ذخیره به گونه ای تعیین گردیده است که محلول 155 mg/dl بعد از رقیق سازی به نسبت 101 /1 و محلول mg/dl‌ 155 بعد از رقیق سازی به نسبت 11 /1 میزان جذبی حدود 4 /0 را نشان دهد. چراکه دستگاه های اسپکتروفتومتری در بازه ی جذب 4 /0 کمترین مقدار خطای عملکردی را به ما نشان خواهند داد.

کالیبراسیون سمپلر با با رنگ سنجی ( محلول پارانيتروفنل )

در این روش به جاي استفاده کردن از رنگ سبز خوراكي، از محلول پارانيتروفنل می توان استفاده کرد. در اين متد با توجه به حجم سمپلر باید محلول ذخیره آماده گردد. سمپلرهایي که حجمی كمتر از 10 ميكروليتر دارند، باید برای تهيه محلول ذخيره آن، 420 ميلي گرم پارانيتروفنل را در 100 ميلي ليتر آب مقطر حل کنید.

• برای سمپلرهای با حجم 1000-100 میکرولیتر: برای انجام این روش 42 میلی گرم از پودر پارانیتروفنل را در یک لیتر آب مقطر باید به حالت محلول درآورید. (غلظت رنگ در این حالت در محلول ذخیره، 42 میلی گرم در لیتر می باشد.)
• سمپلرهای 100-10 میکرولیتر: برای این گروه باید 42 میلی گرم از پودر ذکر شده را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل کرد. (عدد غلظت رنگ برای  محلول ذخیره در این دسته 42 میلی گرم درصد تعیین شده است.)
• سمپلرهای کمتر از 10 میکرولیتر: ابتدا باید 420 میلی گرم پودر پارانتیروفنل نرمال تهیه گردد. در این مورد از سود 01/0 نرمال استفاده می شود، این درحالی است که برای رنگ سبز خوراکی باید از آب مقطر استفاده می شد.

در مورد استفاده از پارانیتروفنل برای کنترل کیفی سمپلر ها و کالیبراسیون سمپلرها 2 حالت پیش می آید، برای 2 دسته اول یک محلول ذخیره و دسته آخر یک محلول دیگر تهیه می شود.

 برای دسته 100-10 میکرولیتر ، غلظت پارانیتروفنل 42 میلی گرم در دسی لیتر می باشد و برای دسته ی  1000-100 میکرولیتر سمپلرها غلظت پارانیتروفنل 42 میلی گرم در لیتر باید تهیه و در نظر گرفته شود. دقت شود که در آماده سازی استوک پارانیتروفنل و سایر رقت های مورد نیاز، از آب مقطر و سود 01/0 نرمال به ترتیب استفاده شود.

در هر یک از روش ها،پس از آماده کردن 10 لوله آزمایش و انتخاب کردن محلول رنگی ذخیره شده با توجه به حجم سمپلر مورد ارزیابی، آب مقطر را به لوله ها اضافه می کنیم. در قدم بعدی به کمک میکروپیپت مورد ارزیابی محلول رنگی برداشته می شود و به لوله ها اضافه می گردد.

پس از مخلوط كردن، میزان جذب نوري برای هر لوله را در طول موج 630 نانومتر در برابر آب مقطر خوانده می شود، با محاسبه کردن ضريب انحراف معيار (CV) ميزان عدم تكرارپذيري محاسبه مي شود. در انجام کارهای روزانه بین 1-3 درصد خطای عدم دقت قابل قبول برآورد می شود.

انحراف معیار = SD / mean × 100

روش دوم : وزن سنجی

کنترل کیفی میکروپیپت یا کالیبراسیون سمپلر با استفاده از روش وزن سنجی مختلف بر اساس استانداردهای مختلف ISO انجام میشود.

روش وزن سنجی با آب به عنوان مایع کالیبراسیون در دمای (0.5 ± 20) درجه سانتیگراد انجام می شود. از این روش برای حجم های بیش از 10 میکرولیتر استفاده می شود.

در هر روش یک جرم مناسب مقایسه کننده برای ثبت جرم برای حجم پیپت داده شده مورد نیاز است. دمای آب و دمای اتاق باید به دقت در طول اندازه گیری کنترل شود.

در این روش، به لوازم زیر احتیاج دارید؛

1. ترازوی دقیق دیجیتال با دقت بالا
2. یک لیوان خشک
3. سر سمپلر
4. و خود سمپلر

در ابتدا وزن لیوان خشک تعیین می شود و بعد جرم حجم مایع (آب) برداشت شده با ریخته شدن آن به درون لیوان روی ترازو مشخص می شود. لیوان دوباره وزن می شود و جرم به دست آمده با بدست آوردن اختلاف اندازه گیری شده جرم حجم مایع برداشته شده توسط سمپلر مشخص می شود. بعد از هر بار اندازه گیری لیوان تمیز شود و این روش 10-20 بار تکرار گردد.

در مرحله بعد، ميانگين وزن ها، انحراف معيار و ضريب تغييرات را محاسبه می کنیم. اگر ضريب تغييرات بيشتر از 2 درصد باشد، می گوییم  سمپلر مورد بررسی از دقت مطلوب برخوردار نیست و نباید از آن قابل استفاده شود.

كنترل صحت (Accuracy) چیست ؟

برای كنترل صحت کارکرد سمپلر از دو روش ذکر شده در بالا می توان استفاده کرد.

كنترل صحت در روش رنگ سنجی

در مورد روش رنگ سنجي مطابق با رقت رنگی که تعیین شد و داخل لوله ها با استفاده از پيپت و بالن ژوژه كلاس A ریختیم ( 1 به 101 ) تعیین می شود و نیز طول موج 630 نانومتر در برابر بلانك آب مقطر خوانده می شود(حداقل 3 مرتبه). سپس میزان جذب نوري محاسبه شده و به عنوان مقدار مرجع در نظر گرفته می شود. میزان جذب نوري بدست آمده برای سمپلر مورد ارزیابی را از اين مقدار كم کرده و نتيجه ی بدست آمده را بر مقدار جذب نوري مرجع تقسيم مي كنيم.

 میزان اختلاف بدست آمده نمایان گر عدم صحت سمپلر مورد بررسی می باشد که اين اختلاف ضربدر 100 درصد Bias بدست مي آيد.

 Bias = (مقدار اندازه گیری شده – مقدارمورد انتظار) /مقدارمورد انتظار x100

بیشترین میزان عدم صحت قابل قبول 5% می باشد.

كنترل صحت در روش وزن سنجی

در روش وزن سنجي، ميانگين وزن هاي محاسبه شده را در فاكتور صحيحي ضرب مي کنیم. براي به دست آوردن این فاکتور تبديل وزن به حجم به دماي آب مقطر و فشار هواي محل نیاز است و با استفاده از این دو محاسبه می شود. بعد اختلاف حجم محاسبه شده با حجم مورد انتظار براي سمپلر مورد بررسی را محاسبه کرده و آن را بر حجم مورد انتظار تقسيم مي كنيم. عدد به دست آمده، میزان واقعي انحراف را نشان می دهد و میزان آن نبايد بیشتر از 3 درصد باشد.

در روش وزن سنجی باید به این موارد توجه شود :

• دماي اتاق در زمان اندازه گیری ها بايد بين 25-20 درجه سانتی گراد و رطوبت محل باید در حدود 90-60 درصد باشد.
• ترازو در محل مناسبی به لحاظ دمایی و همچنین مسطح بودن سطح قرار داشته باشد.
• آب مورد استفاده هم دماي اتاق و مقطر باشد.

نکات مهم در خصوص کنترل کیفی میکروپیپت ها

• هرگز بالاتر یا پایین تر از محدوده حجم سمپلر، حجمی را با آن انتقال ندهید. این کار آن را از حالت کالیبره خارج کرده و به دستگاه آسیب می زند.
• هرگز سمپلری را که حاوی محلول یا مایعات است به پهلو روی سطح رها نکنید و حتما ابتدا آن را تخلیه کنید.
• تمام اقدامات مربوط به کنترل کیفی سمپلرها باید در قالب مستندات برای هر سمپلر درآید و نگهداری شود.
• اعمال فشار بیش از حد در هنگام اتصال سرسمپلر به سمپلر باعث آسیب به شفت پیپت آن می شود.

با رعایت این موارد می توانید بهینه حالت و بیشترین استفاده از سمپلر خود را داشته باشید.

سخن پایانی

همانطور که احتمالا متوجه شدید کنترل کیفی و کالیبراسیون سمپلر یا میکروپیپت ها فرآیندی ضروری و البته نیازند دقت بالاست. در این مطلب تلاش کردیم تا دو مورد از پرکاربردترین روش های کنترل کیفی میکروپیپت را که شامل روش رنگ سنجی و روش وزن سنجی میشود را به شما معرفی کنیم. امیدواریم مطالب این مقاله برایتان مفید بوده باشد. اگر قصد تعویض سمپلر خود را دارید میتوانید با کارشناسان ما در تماس باشید. شما در مجموعه لیان، امکان خرید سمپلر اپندورف و دیگر برندهای معتبر را دارید.